风暴魔域挂机刷魔石,快速培养幻兽升星教程 | 文獻求助論文范文 | 論文題目 | 參考文獻 | 開題報告 | 論文格式 | 摘要提綱 | 論文致謝 | 論文查重 | 論文答辯 | 論文發表 | 期刊雜志 | 論文寫作 | 論文PPT
风暴魔域挂机刷魔石,快速培养幻兽升星教程您當前的位置:风暴魔域挂机刷魔石,快速培养幻兽升星教程 > 醫學論文 > 基礎醫學論文 > 免疫學論文

腾讯风暴魔域怎么赚人民币:巨噬細胞極化中應用合成型Apelin-13的效果

時間:2019-05-24 來源:中華實用診斷與治療雜志 作者:孫夢娜,徐予,陳昌,郝 本文字數:7835字

风暴魔域挂机刷魔石,快速培养幻兽升星教程 www.awyiy.icu   摘    要: 目的 探討合成型Apelin-13對人臍帶源間充質干細胞 (human umbilical cord derived mesenchymal stem cell, HUCMSC) 與單核巨噬細胞THP-1共培養體系中巨噬細胞極化的影響。方法 單核巨噬系細胞THP-1, 復蘇培養后用佛波酯 (phorbol ester, PMA) +脂多糖 (lipopolysaccharides, LPS) +重組人干擾素-γ (interferon-γ, IFN-γ) 誘導為M1型巨噬細胞, 分為空白對照組和低、中、高濃度組, 與HUCMSC共培養后分別用質量濃度為0、100、500、1 000μg/L的Apelin-13進行干預。干預48 h, 應用倒置顯微鏡觀察細胞形態;收集M1型巨噬細胞及共培養體系中上層小室內的貼壁巨噬細胞, 應用流式細胞術檢測細胞膜蛋白CD86及CD206表達;采用ELISA法檢測上清液中白細胞介素 (interleukin, IL) -4、IL-6、IL-10、IL-1β、腫瘤壞死因子-α (tumor necrosis factor-α, TNF-α) 、轉化生長因子-β1 (transforming growth factor-β1, TGF-β1) 表達。結果 Apelin-13干預48 h, THP-1細胞形態由棒狀、放射狀、樹枝狀轉變為圓形、類圓形, 黏附性增強, 細胞內顆粒增多, 且隨Apelin-13濃度增高細胞形態變化明顯;低、中、高濃度組細胞表面膜蛋白CD86陽性表達率[ (5.633±0.153) %、 (3.040±0.529) %、 (2.860±0.531) %]低于空白對照組[ (16.710±0.103) %], CD206陽性表達率[ (93.633±0.351) %、 (94.100±0.266) %、 (97.402±0.265) %]高于空白對照組[ (73.220±1.307) %] (P<0.05) ;中、高濃度組CD86陽性表達率低于低濃度組 (P<0.05) , 中濃度組與高濃度組比較差異無統計學意義 (P>0.05) ;高濃度組CD206陽性表達率高于低、中濃度組 (P<0.05) , 低濃度組與中濃度組比較差異無統計學意義 (P>0.05) 。低、中、高濃度組IL-6 (1.006±0.007、0.682±0.004、0.346±0.004) 、IL-1β (1.468±0.033、0.919±0.014、0.908±0.018) 、TNF-α (0.880±0.004、0.285±0.005、0.278±0.005) 吸光度 (optical density, OD) 值低于空白對照組 (1.417±0.005、1.907±0.004、1.301±0.006) (P<0.05) , IL-4 (0.101±0.004、0.155±0.003、0.248±0.005) 、IL-10 (0.117±0.004、0.154±0.002、0.188±0.002) 、TGF-β1 (0.173±0.006、0.179±0.003、0.322±0.005) OD值高于空白對照組 (0.075±0.002、0.088±0.001、0.073±0.001) (P<0.05) ;中、高濃度組IL-6、IL-1β、TNF-αOD值低于低濃度組 (P<0.05) , IL-4、IL-10 OD值高于低濃度組 (P<0.05) ;高濃度組TGF-β1 OD值高于低濃度組 (P<0.05) ;高濃度組IL-6 OD值低于中濃度組 (P<0.05) , IL-4、IL-10、TGF-β1 OD值高于中濃度組 (P<0.05) , IL-1β、TNF-αOD值與中濃度組比較差異無統計學意義 (P>0.05) 。結論 Apelin-13可促進HUCMSC與THP-1細胞共培養體系中巨噬細胞極化, 增加IL-4、IL-10、TGF-β1等抗炎細胞因子分泌, 且呈濃度依賴性。

  關鍵詞: 巨噬細胞極化; 人臍帶源間充質干細胞; Apelin-13; THP-1細胞;

  Abstract: Objective To study the effect of apelin-13 on macrophage polarization in the co-culture systems of human umbilical cord derived mesenchymal stem cell (HUCMSC) and human macrophage THP-1. Methods M1-type macrophages were induced by phorbol ester (PMA) + lipopolysaccharides (LPS) + recombinant human interferon-γ (IFN-γ) after resuscitation culture of mononuclear cell line (THP-1) cells, and were divided into blank control group, and low-, medium-and high-concentration groups, which were treated with apelin-13 at 0, 100, 500 and 1 000 μg/L after co-cultured with HUCMSC. After intervention for 48 h, the cell morphology was observed by inverted microscope. M1-type macrophages and adhered macrophages in the upper chamber of the co-culture system were collected. The expressions of cell membrane protein CD86 and CD206 were detected by flow cytometry. The levels of interleukin (IL) -4, IL-6, IL-10, IL-1β, tumor necrosis factor-α (TNF-α) and transforming growth factor-β1 (TGF-β1) in the culture supernatant were deteced by ELISA technique. Results Compared with blank control group, 48 h after intervention with apelin-13, THP-1 changed from rod-like, radial and dendritic shape to round and quasi-circular shape, which became more obvious with the increase of apelin-13 concentration, at the same time, the adhesion became strong and number of the intracellular granules increased. The positive rate of CD86 was significantly lower in low-, medium-and high-concentration groups ( (5.633±0.153) %, (3.040±0.529) %, (2.860±0.531) %) than that in blank control group ( (16.710±0.103) %) , lower in medium-and high-concentration groups than that in low-concentration group (P<0.05) , and showed no difference between medium-and high-concentration groups (P>0.05) .The positive rate of CD206 was significantly higher in low-, medium-and high-concentration groups ( (93.633±0.351) %, (94.100±0.266) %, (97.402±0.265) %) than that in blank control group ( (73.220±1.307) %) (P<0.05) , higher in high-concentration group than that in low-and medium-concentration groups (P<0.05) , and showed no difference between low-and medium-concentration groups (P>0.05) .The optical density (OD) values of IL-6 (1.006±0.007, 0.682±0.004, 0.346±0.004) , IL-1β (1.468±0.033, 0.919±0.014, 0.908±0.018) and TNF-α (0.880±0.004, 0.285±0.005, 0.278±0.005) in low-, medium-and high-concentration groups than those in blank control group (1.417±0.005, 1.907±0.004, 1.301±0.006) (P<0.05) , and the OD values of IL-4 (0.101±0.004, 0.155±0.003, 0.248±0.005) , IL-10 (0.117±0.004, 0.154±0.002, 0.188±0.002) and TGF-β1 (0.173±0.006, 0.179±0.003, 0.322±0.005) were significantly higher than those in blank control group (0.075±0.002, 0.088±0.001, 0.073±0.001) (P<0.05) .The OD values of IL-6, IL-1βand TNF-αwere significantly lower and OD values of IL-4 and IL-10 were significantly higher in medium-and high-concentration groups than those in low-concentration group (P<0.05) .The OD value of TGF-β1 was significantly higher in high-concentration group than that in low-concentration group (P<0.05) .The OD value of IL-6 was significantly lower, and OD values of IL-4, IL-10 and TGF-β1 were significantly higher in high-concentration group than those in medium-concentration group (P<0.05) .There were no significant differences in the OD values of IL-1βand TNF-αbetween high-and medium-concentration groups (P>0.05) .Conclusion Apelin-13 can promote the macrophages polarization and the secretion of anti-inflammatory cytokines such as IL-4, IL-10 and TGF-β1 in the co-culture system, which is concentration-dependent with apelin-13.

  Keyword: macrophage polarization; human umbilical cord derived mesenchymal stem cell; apelin-13; THP-1;

  人臍帶源間充質干細胞 (human umbilical cord derived mesenchymal stem cell, HUCMSC) 增殖能力強, 制備方便, 是干細胞治療的新型細胞, 在類風濕性關節炎、卒中、先天性角膜疾病等治療中具有廣闊前景[1], 其免疫調節的作用已被證實[2,3]。單核/巨噬細胞包括M1、M2型, M1型主要表達促炎細胞因子如白細胞介素 (interleukin, IL) -1 、IL-6、腫瘤壞死因子-α (tumor necrosis factor-α, TNF-α) 及細胞表面標志物CD86等;M2型為選擇性激活亞型, 主要表達抗炎細胞因子IL-10、細胞表面標志物CD206等[4,5]。

巨噬細胞極化中應用合成型Apelin-13的效果

  Apelin是G蛋白耦聯受體APJ的內源性配體, 廣泛存在于機體多種器官, 與血管緊張素Ⅱ (angiotensin Ⅱ, Ang Ⅱ) 有31%同源性, 具有擴張血管, 正性肌力, 減少抗利尿激素釋放, 降低血壓, 調節垂體激素釋放, 調節生物節律和抑制人類免疫缺陷病毒侵入等多種生物學效應。合成型Apelin是新型合成多肽藥物, 在缺氧/無血清條件下能夠增強間充質干細胞 (mesenchymal stem cells, MSCs) 抗凋亡能力及其血管化, 上調血管內皮生長因子表達, 促進MSCs的存活及有益細胞因子的分泌[6]。本研究探討合成型Apelin-13對HUCMSC與單核巨噬細胞THP-1共培養體系中巨噬細胞極化的影響, 報道如下。

  1 、材料與方法

  1.1、 一般材料

  單核巨噬細胞THP-1 (中國科學院干細胞庫) ;HUCMSC (鄭州大學人民醫院眼科研究所贈與) ;DMEM/F12培養基、RPMI-1640培養基、胰蛋白酶、PBS (中國北京索萊寶有限公司) ;體積分數10%胎牛血清 (美國Gibco公司) ;鞘液 (中國鑫科醫療器械有限公司) ;佛波酯 (phorbol ester, PMA) 、脂多糖 (lipopolysaccharides, LPS) (美國Sigma公司) ;重組人干擾素-γ (interferon-γ, IFN-γ) (美國Peprotech公司) ;合成型Apelin-13 (美國Cayman公司) ;FITC CD86 和 PE CD206 抗體 (捷克EXBIO公司) ;轉化生長因子- β1 (transforming growth factor-β1, TGF-β1) 、IL-1β、TNF-α、IL-6、IL-10、IL-4 ELISA檢測試劑盒 (深圳欣博盛生物科技有限公司) ;FACS Calibur流式細胞儀 (美國BD公司) ;酶聯免疫檢測儀 (美國Bio-Rad公司) ;倒置顯微鏡 (日本Olympus公司) 。

  1.2、 方法

  1.2.1、 THP-1體外誘導

  THP-1復蘇后離心收集, 加入含體積分數10%胎牛血清的RPMI-1640培養基5 mL, 調整細胞密度為 (2~2.5) ×105/mL, 轉移至25 cm×25 cm×25 cm細胞培養瓶中, 置于37 ℃、體積分數5%CO2飽和濕度培養箱中培養, 根據細胞生長情況每2~3 d換液1次, 直接分瓶傳代。取培養至3~4代的THP-1細胞, 室溫離心后去除培養上清, 加入含體積分數10%胎牛血清的RPMI-1640培養基重懸細胞, 用50 μg/L PMA進行誘導刺激, 接種在6孔板中培養48 h, 獲得未分化巨噬細胞 (M0) [5]。參照文獻[7]方法, 將6孔板內M0細胞進一步用20 μg/L IFN-γ和200 μg/L LPS刺激培養48 h, 誘導為分化型巨噬細胞。倒置顯微鏡下觀察誘導前、后細胞形態變化, 流式細胞儀鑒定細胞表型為M1型巨噬細胞后, 分為空白對照組和低、中、高濃度組進行下一步實驗。

  1.2.2、 HUCMSC與M1型巨噬細胞共培養體系建立

  取生長狀態良好的M1型巨噬細胞, 胰蛋白酶處理后以5×104個/孔接種于12孔Transwell共培養板上層小孔中。貼壁生長6 h后, 取胰蛋白酶處理后的HUCMSC, 以5×105個/孔接種于12孔Transwell共培養板下層小孔中??瞻錐哉兆? 低、中、高濃度組分別加入質量濃度為0、100、500、1 000 μg/L的Apelin-13, 置于37 ℃、體積分數5%CO2飽和濕度培養箱中干預48 h。

  1.2.3 、細胞膜蛋白CD86、CD206表達檢測

  分別收集經 PMA+IFN-γ+LPS刺激48 h的貼壁M1型巨噬細胞, Transwell共培養板上層小室的貼壁巨噬細胞, 調整濃度至1×106/mL, PBS清洗5 min, 50 μL鞘液重懸, 加入PE CD206 及FITC CD86, 避光室溫孵育30 min;鞘液清洗2次, 每次5 min;500 μL鞘液再次重懸后用流式細胞儀檢測。未與抗體作用的巨噬細胞作為流式細胞檢測的陰性對照。

  1.2.4、 細胞因子檢測

  分別收集空白對照組及低、中、高濃度組共培養體系中上層小室的培養上清。按ELISA試劑盒操作說明書, 取出實驗所需板條, 空白孔加標準品和標本通用稀釋液, 其余相應孔內加不同濃度標準品和各組標本 (100 μL/孔, 各孔均設雙孔檢測) , 用封板膠紙封住反應孔, 37 ℃孵育90 min;用洗滌液洗板5次, 每次30 s, 空白孔分別加入生物素標記人IL-6、TNF-α、IL-4、IL-10、TGF-β1、IL-1β抗體稀釋液, 其余孔加生物素化抗體工作液 (100 μL/孔) , 37 ℃孵育60 min;用洗滌液洗板5次, 每次30 s, 空白孔加酶結合物稀釋液, 其余孔加酶結合物工作液 (100 μL/孔) , 37 ℃避光孵育30 min; 用洗滌液洗板5次, 每次30 s, 加入顯色底物TMB 100 μL/孔, 37 ℃避光孵育15 min; 加入終止液100 μL/孔, 酶標儀測定450 nm波長處吸光度 (optical density, OD) 值。

  1.3 、統計學處理

  應用Origin8.5軟件或SPSS 19.0軟件進行統計分析, 計量資料以均數±標準差(X???±s)(X?±s)表示, 2組間比較采用t檢驗, 多組間比較采用單因素方差分析和LSD檢驗, 檢驗水準α=0.05。

  2、 結 果

  2.1 誘導后M1型巨噬細胞形態

  THP-1細胞呈類圓形, 懸浮生長 (圖1a) ;經PMA+IFN-γ+LPS誘導后, 細胞形態逐漸不規則, 胞體增大, 細胞表面伸出偽足, 呈樹突狀、梭狀及放射狀, 誘導6 h逐漸貼壁, 24 h基本貼壁, 48 h后完全貼壁生長為M1型巨噬細胞 (圖1b) 。流式細胞儀檢測顯示M1型巨噬細胞比例>92%, 適用于后續試驗。

  圖1 THP-1細胞和M1型巨噬細胞形態圖 (倒置顯微鏡, ×100)
圖1 THP-1細胞和M1型巨噬細胞形態圖 (倒置顯微鏡, ×100)

  注:a為誘導前THP-1細胞;b為PMA+IFN-γ+LPS誘導48 h后的M1型巨噬細胞。

  2.2 、4組Apelin-13干預48h巨噬細胞形態

  Apelin-13干預48 h, 細胞形態由棒狀、放射狀以及樹枝狀轉變為圓形、類圓形, 黏附性增強, 細胞內顆粒增多, 隨Apelin-13濃度增高細胞形態變化越明顯。見圖2。

  圖2 4組Apelin-13干預48h細胞形態圖 (倒置顯微鏡, ×200)
圖2 4組Apelin-13干預48h細胞形態圖 (倒置顯微鏡, ×200)

  注:a為空白對照組;b為低濃度組;c為中濃度組;d為高濃度組。

  2.3、 4組細胞膜蛋白CD86、CD206陽性表達率比較

  Apelin-13干預48 h, 低、中、高濃度組細胞表面膜蛋白CD86陽性表達率低于空白對照組, CD206陽性表達率高于空白對照組 (P<0.05) ;中、高濃度組CD86陽性表達率低于低濃度組 (P<0.05) , 中濃度組與高濃度組比較差異無統計學意義 (P>0.05) ;高濃度組CD206陽性表達率高于低、中濃度組 (P<0.05) , 低濃度組與中濃度組比較差異無統計學意義 (P>0.05) 。見表1。

  表1 4組細胞膜蛋白CD86、 CD206陽性表達率比較
表1 4組細胞膜蛋白CD86、 CD206陽性表達率比較

  注:a與空白對照組比較, P<0.05;b與低濃度組比較, P<0.05;c與中濃度組比較, P<0.05。

  2.4、 4組細胞因子表達比較

  Apelin-13干預48 h, 低、中、高濃度組IL-6、IL-1β、TNF-α OD值低于空白對照組 (P<0.05) , IL-4、IL-10、TGF-β1 OD值高于空白對照組 (P<0.05) ;中、高濃度組IL-6、IL-1β、TNF-α OD值低于低濃度組, IL-4、IL-10 OD值高于低濃度組 (P<0.05) ;高濃度組TGF-β1 OD值高于低濃度組 (P<0.05) ;高濃度組IL-6 OD值低于中濃度組, IL-4、IL-10、TGF-β1 OD值高于中濃度組 (P<0.05) , IL-1β、TNF-α OD值與中濃度組比較差異無統計學意義 (P>0.05) 。見表2。

  表2 4組細胞因子表達比較
表2 4組細胞因子表達比較

  注:a與空白對照組比較, P<0.05;b與低濃度組比較, P<0.05;c與中濃度組比較, P<0.05。

  3、 討 論

  單核-巨噬細胞系統是機體重要的免疫防御系統, M1型巨噬細胞通過分泌促炎細胞因子以及趨化因子參與正向免疫, 發揮免疫監視功能;M2型巨噬細胞通過分泌抑制性細胞因子對免疫應答進行負向調節[8]。MSCs可調節參與機體固有免疫和特異性免疫的多種細胞, 促進單核-巨噬細胞系統巨噬細胞向M2型分化[9]。研究結果[10]證實, HUCMSC也可通過調節一氧化氮合酶和前列腺素E2水平促進小鼠巨噬細胞從M1型分化為M2型。

  本研究結果顯示, Apelin-13干預48 h, 巨噬細胞形態轉變為圓形、類圓形, 黏附性增強, 細胞內顆粒增多, 隨Apelin-13濃度增高細胞形態變化逐漸明顯;低、中、高濃度組細胞表面膜蛋白CD86陽性表達率低于空白對照組, CD206陽性表達率高于空白對照組, 中、高濃度組CD86陽性表達率低于低濃度組, 高濃度組CD206陽性表達率高于低、中濃度組, 說明Apelin-13可抑制M1型巨噬細胞活性, 促進M1型巨噬細胞向M2型巨噬細胞分化。文獻[11]報道, Apelin-13可抑制巨噬細胞來源的脂蛋白脂肪酶活性, 減少脂質積累, 抑制促炎細胞因子如IL-6、IL-1β、TNF-α等分泌。研究結果[12]顯示, Apelin-13可通過調節核因子-κB/JNK信號通路抑制炎性反應, 在缺氧條件下?;ば∈缶奘上赴饈艿蟯? 并可增強細胞遷移能力。本研究結果顯示, Apelin-13干預48 h, 低、中、高濃度組IL-6、IL-1β、TNF-α OD值低于空白對照組, IL-4、IL-10、TGF-β1 OD值高于空白對照組;中、高濃度組IL-6、IL-1β、TNF-α OD值低于低濃度組, IL-4、IL-10 OD值高于低濃度組;高濃度組TGF-β1 OD值高于低濃度組, IL-6 OD值低于中濃度組, IL-4、IL-10、TGF-β1 OD值高于中濃度組, 說明Apelin-13可促進HUCMSC與THP-1共培養體系中巨噬細胞由M1型向M2型分化, 抑制M1型巨噬細胞分泌促炎細胞因子, 促進抗炎細胞因子分泌, 且細胞因子分泌與Apelin-13濃度呈劑量依賴性, 與文獻[11,12]報道相符。

  有文獻[13]報道, 在心臟反應性纖維化期間應用Apelin可防止心肌結構重塑和心功能不全。本研究為心肌損傷后心肌細胞修復的臨床研究提供了新的思路, 具有一定的理論意義。但Apelin-13在體內是否可促進M1型巨噬細胞向M2型分化, 需進一步進行研究。此外, 本研究未進行拮抗實驗, 不能證實Apelin-13的作用與Apelin/APJ系統直接相關。

  參考文獻:

  [1] QIAN L, HUANG Y, SPENCER I C, et al.In vivo reprogramming of murine cardiac fibroblasts into induced cardiomyocytes[J].Nature, 2012, 485 (7400) :593-598.
  [2] ZHU J, LIU Q, JIANG Y, et al.Enhanced angiogenesis promoted by human umbilical mesenchymal stem cell transplantation in stroked mouse is Notch1 signaling associated[J].Neuroscience, 2015, 290:288-299.
  [3] 張藝凡, 胡方方, 秦方圓, 等.人臍帶間充質干細胞與腫瘤治療研究進展[J].中華實用診斷與治療雜志, 2017, 31 (4) :403-406.
  [4] MURRAY P J, ALLEN J E, BISWAS S K, et al.Macrophage activation and polarization:nomenclature and experimental guidelines[J].Immunity, 2014, 41 (1) :14-20.
  [5] LV R, BAO Q, LI Y, et al.Regulation of M1 type and M2 type macrophage polarization in RAW264.7 cells by Galectin 9[J].Mol Med Rep, 2017, 16 (6) :9111-9119.
  [6] HOU J, ZHONG T, GUO T, et al.Apelin promotes mesenchymal stem cells survival and vascularization under hypoxic-ischemic condition in vitro involving the upregulation of vascular endothelial growth factor[J].Exp Mol Pathol, 2017, 102 (2) :203-209
  [7] MARTINEZ F O, GORDON S, LOCATI M, et al.Transcriptional profiling of the human monocyte-to-macrophage differentiation and polarization:new molecules and patterns of gene expression[J].J Immunol, 2006, 177 (10) :7303.
  [8] TUGAL D, LIAO X, JAIN M K.Transcriptional control of macrophage polarization[J].Arterioscler Thromb Vasc Biol, 2013, 33 (6) :1135-1144.
  [9] 尹學紅, 龐春燕, 白力, 等.脂肪間充質干細胞促進M1型巨噬細胞向M2型巨噬細胞轉化[J].細胞與分子免疫學雜志, 2016, 32 (3) :332-338.
  [10] YIN Y, HAO H, CHENG Y, et al.The homing of human umbilical cord-derived mesenchymal stem cells and the subsequent modulation of macrophage polarization in type 2 diabetic mice[J].Int Immunopharmacol, 2018, 60:235-245
  [11] ZHANG X, YE Q, GONG D, et al.Apelin-13 inhibits lipoprotein lipase expression via the APJ/PKCα/miR-361-5p signaling pathway in THP-1 macrophage-derived foam cells[J].Acta Biochim Biophys Sin (Shanghai) , 2017, 49 (6) :530-540.
  [12] YANG F, BAI Y, JIANG Y, et al.Effects of Apelin on RAW264.7 cells under both normal and hypoxic conditions[J].Peptides, 2015, 69:133-143.
  [13] PCHEJETSKI D, FOUSSAL C, ALFARANO C, et al.Apelin prevents cardiac fibroblast activation and collagen production through inhibition of sphingosine kinase[J].Eur Heart J, 2012, 33 (18) :2360-2369.

    孫夢娜,徐予,陳昌,郝家亮,岳鳳陽,張春麗,孫志闊.Apelin-13對巨噬細胞極化的影響[J].中華實用診斷與治療雜志,2019,33(05):435-438.
      相關內容推薦
    相近分類: